分析mRNA 穩(wěn)定性

由于 mRNA 的完整性和純度對于保障 mRNA 疫苗的有效性和安全性至關(guān)重要，因此擁有監(jiān)測這方面的工具非常重要。mRNA分子的各種屬性共同決定了產(chǎn)品是否可以正常發(fā)揮作用。Poveda等人的綜述重點介紹了這些屬性，并簡要介紹了通常用于評價和監(jiān)控它們的方法。

表3提供了完整的分析評價方法列表，用于確定和監(jiān)測 mRNA 疫苗原料藥和終藥品的質(zhì)量屬性和穩(wěn)定性。目前在公開資料中仍然無法獲得已獲批使用的mRNA-LNP疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，泄露的相關(guān)文件中提到mRNA 完整性的百分比應(yīng)在70% 到 75% 之間，EMA 的評估報告寫道：“在當(dāng)前大流行的緊急情況下提交的這種醫(yī)藥產(chǎn)品的質(zhì)量被認為是足夠一致和可接受的。"

表3 測定和監(jiān)測 mRNA 原料藥和 mRNA-LNP產(chǎn)品質(zhì)量屬性和穩(wěn)定性。

縮寫：AF4，非對稱流場-流分餾；AFM，原子力顯微鏡；dsDNA，雙鏈 DNA；DLS，動態(tài)光散射；ESEM，環(huán)境掃描電子顯微鏡；IEX-HPLC，離子交換高效液相色譜；IP-HPLC，離子對高效液相色譜；MALS，多角度光散射；NTA ，納米粒子追蹤分析；qPCR，定量聚合酶鏈反應(yīng)；RP-HPLC，反相高效液相色譜；SE-HPLC，體積排阻高效液相色譜；TEM，透射電子顯微鏡；TRPS，可調(diào)電阻脈沖感應(yīng)。

在這里，我們詳細介紹了適用于研究 mRNA 完整性和用于質(zhì)量控制 (QC) 的技術(shù)。Schmidt 概述了歐盟當(dāng)局要求的以 mRNA 疫苗為重點的研究藥品檔案 (IMPD) 的質(zhì)量文件，感興趣的讀者可以參考該信息性文件了解詳細信息。由于許多描述的方法旨在檢測裸露的 mRNA，而mRNA 疫苗包封在 LNP中，因此對于某些檢測，首先需要從LNP 中釋放出mRNA，可以通過適當(dāng)?shù)目刂苼砜紤]此過程的潛在影響。

凝膠電泳是一種常用的技術(shù)，可以提供有關(guān) mRNA 大小和完整性的信息。當(dāng) mRNA 降解并發(fā)生鏈斷裂時，mRNA 鏈變短。因此，預(yù)期 mRNA 長度處的條帶強度會降低或條帶會變寬，同時可能會出現(xiàn)新的條帶。

Démoulins等人使用凝膠電泳法分析了在無RNase 條件下SAM 的質(zhì)量。根據(jù)凝膠電泳數(shù)據(jù)，他們能夠確定 mRNA 是否具有可接受的質(zhì)量和穩(wěn)定性，目前已研發(fā)出商用電泳設(shè)備用于 mRNA 的高通量分析。

張等人報道了熒光相關(guān)光譜 (FCS) 可用于監(jiān)測 mRNA 大小的變化，主要原理是通過熒光標(biāo)記的mRNA 的布朗運動來計算分子量。然而，這種技術(shù)需要熒光標(biāo)記，與凝膠電泳相比準(zhǔn)確度并不一定更高，并且只能檢測到包括分子量發(fā)生變化的mRNA 降解，例如鏈斷裂等。

在整個（生物）制藥行業(yè)，色譜技術(shù)形成了一個強大的平臺來監(jiān)測藥物的純度和穩(wěn)定性。然而，迄今為止，用于確定 mRNA 分子純度和穩(wěn)定性的HPLC技術(shù)的開發(fā)進展緩慢。分析大 分子mRNA的成功方案可以在文獻以及闡述 RP-HPLC、SE-HPLC、IP-HPLC 和 IEX-HPLC 方法的文獻中找到，其中一些技術(shù)也可用于mRNA 制備純化。IEX-HPLC 可用于測量游離和LNP 包封的 mRNA。前面提到的RiboGreen技術(shù)可以建立相同參數(shù)的正交技術(shù)，然而使用相同的mRNA-LNP樣品卻測定出了不同的含量結(jié)果；與RiboGreen 數(shù)據(jù)相比，IEX-HPLC 結(jié)果與體內(nèi)數(shù)據(jù)的相關(guān)性更好。這說明即使是像 RiboGreen 檢測這樣的成熟技術(shù)，也應(yīng)該根據(jù)具體情況進行詳細驗證。

mRNA 降解也可以通過RT-qPCR進行分析，使用方法可以測定能轉(zhuǎn)錄成完整目標(biāo)cDNA的mRNA 總量，這表明所有影響這個過程的因素都可以間接定量檢測。Brisco 和 Morley對 RT-qPCR技術(shù)進行評估，認為它的定量結(jié)果是可靠的。RT-qPCR技術(shù)的另一個優(yōu)點是能定量檢測影響轉(zhuǎn)錄的所有類型的降解，而之前討論的其它技術(shù)只能檢測mRNA 的大小。然而，，RT-qPCR 技術(shù)也有一定的局限性，由于所用酶存在錯誤率，導(dǎo)致結(jié)果有時不太可靠。而且RT-qPCR 技術(shù)這目前沒有被廣使用，并且無法區(qū)分不同類型的降解。

mRNA體外（細胞內(nèi)）表達也用于分析mRNA的完整性，通過使用編碼熒光蛋白的mRNA，可以通過測量熒光信號間接確定mRNA 的完整性。這種方法有助于為生物活性 mRNA-LNP 設(shè)計和chu方篩選研究提供指導(dǎo)。或者，可以使用酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 或蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（WB）來確定編碼非熒光抗原的mRNA 的翻譯功效。這種方法的優(yōu)點是它給出了制劑的整體完整性和可能影響 mRNA 轉(zhuǎn)錄的所有因素的總和。這種方法的局限性是不是很精確，無法明確mRNA破壞的類型，并且耗時。